Dit eerste geval van genetische manipulatie bij een hagedis heeft een modelorganisme gecreëerd dat kan helpen om meer inzicht te krijgen in de evolutie en ontwikkeling van reptielen
CRISPR-Cas9 of gewoon CRISPR is een uniek, snel en voordelig gen bewerkingstool waarmee een genoom kan worden bewerkt door te verwijderen, toe te voegen of te wijzigen DNA. De afkorting CRISPR staat voor 'Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats'. Deze tool is eenvoudig en nauwkeuriger dan eerdere bewerkingsmethoden DNA.
CRISPR-Cas9-tool injecteert organismen in het zygote (eencellige) stadium met een DNA-construct gemaakt van (a) Cas9-enzym dat fungeert als 'schaar' en een deel van DNA kan knippen of verwijderen, (b) RNA leiden - een sequentie die komt overeen met het doelgen en leidt zo het Cas9-enzym naar de doellocatie. Zodra een doelgedeelte van het DNA is doorgesneden, zal het DNA-reparatiemechanisme van de cel zich opnieuw aansluiten bij de resterende streng en, in het proces, het doelgen tot zwijgen brengen. Of het gen kan worden 'gecorrigeerd' door een nieuwe gemodificeerde DNA-sjabloon te gebruiken in een proces dat homologiegerichte reparatie wordt genoemd. De CRISPR-Cas9-tool maakt dus genetische modificaties mogelijk door te injecteren genbewerking oplossingen in een eencellige bevruchte eicel. Dit proces veroorzaakt een genetische verandering (mutatie) in alle volgende cellen die worden geproduceerd, waardoor de genfunctie wordt beïnvloed.
Hoewel CRISPR-Cas9 routinematig wordt gebruikt bij veel soorten, waaronder vissen, vogels en zoogdieren, is het tot nu toe niet succesvol geweest in het genetisch manipuleren van reptielen. Dit komt voornamelijk door twee barrières. Ten eerste slaan vrouwelijke reptielen sperma voor lange termijn op in hun eileider, waardoor het moeilijk is om het exacte tijdstip van bevruchting te bepalen. Ten tweede heeft de fysiologie van de eieren van reptielen veel kenmerken, zoals buigzame eierschalen, kwetsbaarheid zonder luchtruimte binnenin, waardoor het een uitdaging is om de embryo's te manipuleren zonder scheuren of schade te veroorzaken.
In een artikel geüpload op bioRxiv op 31 maart 2019 hebben onderzoekers gerapporteerd over de ontwikkeling en het testen van een manier om CRISPR-Cas9 te gebruiken genbewerking voor het eerst bij reptielen. De in het onderzoek gekozen reptielsoort was tropisch hagedis Dit betekent dat we onszelf en onze geliefden praktisch vergiftigen. Anolis Sagrei of meer algemeen bruine anol die wijdverbreid is in het Caribisch gebied. De hagedissen in de studie werden verzameld in een wilde regio in Florida, VS. Deze soort is bij uitstek geschikt voor het onderzoek vanwege zijn miniatuurgrootte, lange broedseizoen en relatief korte gemiddelde tijd tussen twee generaties.
Om de beperkingen te overwinnen die momenteel met reptielen worden geconfronteerd, micro-injecteerden onderzoekers CRISPR-componenten in onrijpe onbevruchte eieren terwijl de eieren zich vóór de bevruchting nog in de eierstokken van vrouwelijke hagedissen bevonden. Ze waren gericht op het tyrosinase-gen dat een enzym produceert dat de huidpigmentatie bij hagedissen regelt en als dit gen wordt verwijderd, zou de hagedis als een albino worden geboren. Dit duidelijke pigmentatiefenotype was de reden om voor het tyrosinasegen te kiezen. De micro-geïnjecteerde eieren rijpen vervolgens in het vrouwtje en worden vervolgens op natuurlijke wijze bevrucht met een geïntroduceerd mannelijk of opgeslagen sperma.
Als gevolg hiervan werden enkele weken later vier albino-hagedissen geboren, wat bevestigde dat het gentyrosinase was gedeactiveerd en dat de genbewerking proces was succesvol. Omdat het nageslacht bewerkte genen van beide ouders bevatte, was het duidelijk dat CRISPR-componenten veel langer actief bleven in de onvolgroeide eicel van de moeder en dat het na de bevruchting de genen van de vader muteerde. Mutante albinohagedissen vertoonden dus gemanipuleerde tyrosinase in genen die van zowel moeder als vader waren geërfd, aangezien albinisme een eigenschap is die van beide ouders is geërfd.
Dit is de eerste studie ooit om genetisch gemodificeerde reptielen effectief te produceren. Het onderzoek zou op een vergelijkbare manier kunnen werken bij andere hagedissoorten zoals slangen waarvoor de huidige benaderingen tot nu toe niet succesvol zijn geweest. Dit werk zou kunnen helpen om meer inzicht te krijgen in de evolutie en ontwikkeling van reptielen.
***
{Dit onderzoek is momenteel ingediend voor peer review. U kunt de preprint-versie lezen door op de DOI-link hieronder te klikken in de lijst met geciteerde bron(nen)}
Bron (nen)
Rasys AM et al. 2019. Voordruk. CRISPR-Cas9 Genbewerking bij hagedissen door micro-injectie van onbevruchte eicellen. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
