Dit eerste geval van genetische manipulatie bij een hagedis heeft een modelorganisme gecreëerd dat kan helpen om meer inzicht te krijgen in de evolutie en ontwikkeling van reptielen
CRISPR-Cas9, of kortweg CRISPR, is een unieke, snelle en goedkope methode voor genbewerking waarmee een genoom kan worden bewerkt door DNA te verwijderen, toe te voegen of te veranderen . De afkorting CRISPR staat voor 'Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats'. Deze methode is eenvoudig en nauwkeuriger dan eerdere methoden voor DNA- bewerking.
De CRISPR-Cas9-tool injecteert organismen in het zygote-stadium (ééncellig stadium) met een DNA-constructie bestaande uit (a) het Cas9-enzym, dat fungeert als een 'schaar' en een deel van het DNA kan knippen of verwijderen, en (b) gids-RNA – een sequentie die overeenkomt met het doelgen en zo het Cas9-enzym naar de doellocatie leidt. Zodra een deel van het doel-DNA is geknipt, zal het DNA-reparatiemechanisme van de cel de resterende streng weer aan elkaar hechten en daarbij het doelgen uitschakelen. Het gen kan ook worden 'gecorrigeerd' door een nieuwe, gemodificeerde DNA-template te gebruiken in een proces dat homologie-gerichte reparatie wordt genoemd. De CRISPR-Cas9-tool maakt dus genetische modificaties mogelijk door genbewerkingsoplossingen in een eencellige bevruchte eicel te injecteren . Dit proces veroorzaakt een genetische verandering (mutatie) in alle daaropvolgende cellen die worden geproduceerd, waardoor de genfunctie wordt beïnvloed.
Hoewel CRISPR-Cas9 routinematig wordt gebruikt bij veel soorten, waaronder vissen, vogels en zoogdieren, is het tot nu toe niet succesvol geweest in het genetisch manipuleren van reptielen. Dit komt voornamelijk door twee barrières. Ten eerste slaan vrouwelijke reptielen sperma voor lange termijn op in hun eileider, waardoor het moeilijk is om het exacte tijdstip van bevruchting te bepalen. Ten tweede heeft de fysiologie van de eieren van reptielen veel kenmerken, zoals buigzame eierschalen, kwetsbaarheid zonder luchtruimte binnenin, waardoor het een uitdaging is om de embryo's te manipuleren zonder scheuren of schade te veroorzaken.
In een artikel dat op 31 maart 2019 op bioRxiv werd gepubliceerd, hebben onderzoekers de ontwikkeling en het testen beschreven van een methode om voor het eerst CRISPR-Cas9- genbewerking toe te passen bij reptielen. De reptielsoort die voor het onderzoek werd gekozen, was een tropische hagedis genaamd Anolis sagrei , beter bekend als de bruine anolis, die wijdverspreid is in het Caribisch gebied. De hagedissen in het onderzoek werden verzameld in een natuurgebied in Florida, VS. Deze soort is bij uitstek geschikt voor het onderzoek vanwege zijn kleine formaat, lange voortplantingsseizoen en relatief korte gemiddelde tijd tussen twee generaties.
Om de beperkingen te overwinnen die momenteel met reptielen worden geconfronteerd, micro-injecteerden onderzoekers CRISPR-componenten in onrijpe onbevruchte eieren terwijl de eieren zich vóór de bevruchting nog in de eierstokken van vrouwelijke hagedissen bevonden. Ze waren gericht op het tyrosinase-gen dat een enzym produceert dat de huidpigmentatie bij hagedissen regelt en als dit gen wordt verwijderd, zou de hagedis als een albino worden geboren. Dit duidelijke pigmentatiefenotype was de reden om voor het tyrosinasegen te kiezen. De micro-geïnjecteerde eieren rijpen vervolgens in het vrouwtje en worden vervolgens op natuurlijke wijze bevrucht met een geïntroduceerd mannelijk of opgeslagen sperma.
Als gevolg hiervan werden enkele weken later vier albino hagedissen geboren, wat bevestigde dat het gen voor tyrosinase was gedeactiveerd en het genbewerkingsproces succesvol was verlopen. Omdat de nakomelingen bewerkte genen van beide ouders bevatten, was het duidelijk dat de CRISPR-componenten veel langer actief bleven in de onrijpe eicel van de moeder en na de bevruchting de genen van de vader muteerden. De gemuteerde albino hagedissen vertoonden dus gemanipuleerde tyrosinase in genen die van zowel de moeder als de vader waren geërfd, aangezien albinisme een eigenschap is die van beide ouders wordt overgeërfd.
Dit is de eerste studie ooit om genetisch gemodificeerde reptielen effectief te produceren. Het onderzoek zou op een vergelijkbare manier kunnen werken bij andere hagedissoorten zoals slangen waarvoor de huidige benaderingen tot nu toe niet succesvol zijn geweest. Dit werk zou kunnen helpen om meer inzicht te krijgen in de evolutie en ontwikkeling van reptielen.
***
Bron (nen)
Rasys AM et al. 2019. Preprint. CRISPR-Cas9 -genbewerking bij hagedissen door middel van micro-injectie van onbevruchte eicellen. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
***
